“以药测证” 研究证本质
肾的研究由于五脏病理表现在临床上属于“证”的范畴，故自然而然亦会进入“证”本质的研究。“证”是中医的精华，不同的证反映了人体不同的病理生理状态，辨证就能发现人体的隐潜性变化。80年代中期以前的研究主要从脏腑辨证入手，脏腑辨证是脏象辨别，就是按《内经》所说“藏(脏)居于内，形见于外”，从病人的外象来推论证。方剂辨证是在医圣张仲景所著《伤寒论》中是按“有是证用是方(汤)”，以方剂从证效关系来辨别辨证正确与否，这里显示“证”的存在是由药物效验而成立，有治疗性验证之意。方剂辨证有利于“证”本质的研究，从此开始了“以药测证”来研究证的本质。
（一）肾阳虚证涵盖着NEI 网络，其调控中心在下丘脑
下丘脑是机体重要的整合中枢，也是神经内分泌系统与免疫系统联结的枢钮，有人称之为神经内分泌免疫网络中枢。Basedovsky提出著名的“神经内分泌免疫网络”(即NEI网络)学说，过去认为各司其职的神经、内分泌、免疫三个系统构成了一个完整的相互作用的网络系统，这是现代医学从局部观点到整体观念的一大发展和进步，已成为国际上研究热点之一，但还缺少调节网络的手段。
1979年起，通过对肾阳虚患者的下丘脑—垂体所辖甲状腺、性腺、肾上腺皮质轴这三条内分泌轴进行了全套功能测定和治疗前后分析比较，并同时与同病异证的无肾阳虚证患者作为对照组进行对比观察。经过3年多有计划、有步骤的努力，结果证明肾阳虚患者在这三条轴的不同水平上，都有不同程度的紊乱，而且正是运用逆向思维的论证方法，推断肾阳虚的主要病理改变可能在下丘脑(或更高中枢)。肾阳虚证患者这三个内分泌轴上的功能紊乱在内分泌领域里未能符合“病”的诊断标准，它属于一种隐潜性变化。
80年代起观察到温补肾阳的补肾益寿片对老年补肾组(人)的血清睾酮有明显提高作用，而用四君子汤的老年健脾组则无作用。从1982年更进一步采用受体分子水平的检测方法来研究，发现补肾药确能作用于下丘脑的双氢睾酮受体，提高其亲和力，因此也从理论上证实“肾阳虚证”的病理主要在下丘脑(或更高中枢)。通过药物验证的对比研究，说明补肾药可直接作用于下丘脑，并成为肾阳虚定位研究的重要证据之一。
90年代起，以外源性皮质酮造成大鼠下丘脑—垂体—肾上腺—胸腺(HPAT)轴功能抑制模型(亦是NEI网络受抑模型)以模拟“肾阳虚”作实验，观察到温补肾阳的右归饮能有效改善HPAT轴的功能，尤其是下丘脑的促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)神经元和神经纤维，故选用右归饮的代表性药物附子的主要成分乌头碱，以观察正常大鼠下丘脑CRH的形态与功能的变化。结果显示，乌头碱可使下丘脑室旁核与正中隆起的CRH含量明显增加，同时亦见到CRH神经元与神经纤维明显增加。说明温肾药可直接作用于下丘脑，调节NEI网络，并成为肾阳虚定位研究的重要证据之二。
以后，采用3类复方(补肾、健脾、活血)在皮质酮大鼠模型上，观察到3个药物组治疗的对比中，唯有补肾药能明显地提高已受抑的下丘脑CRHmRNA的表达量，从而调节改善了HPAT轴受抑状态，至此可以说肾阳虚证的主要调节点定位在下丘脑，也可以说是攻克了一个难点。归纳其“思路”是认识到证是功能态，不企望肾阳虚证找到一个和西医直觉的、解剖的、形态的相对应的脏器或组织，而在于找到调节失衡的发病部位与治疗的调节点；亦就是对肾阳虚证进行功能定位，其“方法”是从临床(疗效)到实验(动物)到药物(验证)成为一个系统的研究；汲取了近代科学发展的先进学术思想和手段，如神经内分泌免疫学说、激素—受体—基因激活机制，使肾阳虚证的研究从定性、定量到定位得到逐步的阐明。
1995年在皮质酮大鼠(下丘脑－垂体－肾上腺－胸腺HPAT轴受抑模型，其实亦就是NEI网络受抑模型)观察温补肾阳的右归饮[5]及自拟命门合剂[6]的调节作用，结果模型大鼠下丘脑单胺类递质含量紊乱，HPAT轴形态与功能以及细胞免疫功能全面受到抑制，温补肾阳两个方药均能有效改善上述指标，说明肾阳虚证与NEI 网络有内在联系，补肾药是调节下丘脑、NEI网络、HPAT轴的有效手段，成为肾阳虚证定位研究依据之三。
1996年选用温补肾阳代表性药物附子的主要成分乌头碱[7]对正常大鼠下丘脑CRH形态与功能的影响，结果表明乌头碱腹腔注射的3个不同剂量组使下丘脑室旁核与正中隆起的CRH含量呈依赖性增高、免疫组化显示室旁核与正中隆起的神经元、神经纤维染色增多增深，进一步证明了温补肾阳药对下丘脑的特异性调节作用，成为肾阳虚证定位在下丘脑的依据之四。
1997年采用RT-PCR化学发光定量方法比较补肾、健脾、活血三类方药对皮质酮大鼠下丘脑促肾上腺皮质激素释放激素CRF mRNA表达及HPAT轴的影响[8]，结果表明，惟有补肾阳方药能明显提高皮质酮大鼠下丘脑CRF mRNA的表达量，并有效地保护外源性皮质酮对HPAT轴功能的抑制，使得神经内分泌和免疫各指标均相应有显著改善，而健脾与活血药则无此作用，说明温补肾阳方药是直接提高CRF mRNA 表达水平，从而调节了HPAT轴的受抑状态，成为肾阳虚证定位在下丘脑的依据之五。
至此，多方面的证据说明肾阳虚证的调控中心定位在下丘脑，当然，下丘脑还会受到更高中枢及其它中枢的调节，而且补肾药对外周效应器官亦有广泛直接的调节作用。
从脏腑辨证着手，由3个轴的功能紊乱推论，肾阳虚证发病环节在下丘脑；从方剂辨证着手，认为肾阳虚证涵盖着NEI 网络，其调控中心在下丘脑。这样：“证是一种综合性的功能态，有具体的功能网络和调控中心”。
（二）补肾调控基因网络延缓衰老
80年代曾将肾虚与老年人的神经内分泌指标作对比研究，以科学的证据认定衰老是生理性肾虚。衰老是生命历程中重要的阶段，延缓衰老亦是世界瞩目的课题。1996年免疫衰老研究权威Miller指出，衰老时T细胞凋亡可能是重要的因素，以后的研究证实了衰老时T细胞是过度凋亡，这为我们从T细胞凋亡的角度研究补肾延缓衰老以及肾虚证提供了重要的切入口。
1999年我们观察到两种补肾复方组对老龄大鼠的T细胞凋亡率都比活血复方组以及未服药的对照组明显降低，并接近于年轻大鼠的细胞凋亡水平[10]。同时，补肾复方都能够使老年大鼠的FasL基因表达下调。T细胞凋亡受到基因表达的严密调控，免疫衰老与Fas系统关系最引人注目，其中FasL被称为T细胞死亡因子，衰老时“上调”从而加速T 细胞凋亡，现在国际上还没有一种手段能使FasL“下调”，补肾看来是选择性地下调FasL，从而延缓免疫衰老。以上亦说明如果没有“肾”本质这四十年的“证明性研究”，中西医结合的研究是难以过渡到现代生命科学领域的。中西医结合把中医理论的说理能力以及治病的可信度推向了当今的国际前沿水平。同时亦发扬了中医擅长于调控基因功能的优势，进入了后基因时代，中医药必将在未来的生命科学中占有重要地位而发挥其独特作用。
1997年开始，先在老年人和老年大鼠与年轻人(鼠)相比较中，发现的确存在T细胞过度凋亡，沈老师采用补肾、健脾、活血复方分别对老年人、老年大鼠(衰老模型)以及皮质酮大鼠(肾阳虚证模型)的T细胞凋亡及其相关基因调控模式进行了对比研究。结果观察到凡是补肾复方治疗的老年(人及大鼠)组与皮质酮鼠组T细胞凋亡率都比健脾、活血复方组、以及未服药的对照组明显降低，并接近年轻组的细胞凋亡水平，同时补肾复方都能够使老年(人及鼠)组与皮质酮鼠组的促凋亡基因表达下调与抗凋亡基因表达上调。除了单基因遗传病，基因是不能单独发挥作用，基因的活动是涉及基因组一群基因形成大、小网络协同活动，基因间的相互作用是一种网状式的调节，即牵一发而动全身式的调节。基因网络还存在着互相对立又互相依赖的对子，其中某一个基因的功能衰退或亢进，必然引起平衡失调，衰老、疾病、证候亦就是不同层次的基因网络失衡。人体本来有强大的调节能力，一旦自身不能克服这种不平衡，就不得不依赖药物等治疗手段。从以上结果表明补肾复方对老年和肾虚(人和鼠)证在T细胞凋亡及相关基因群的调控方面具有基本一致的模式，就是使高表达的促凋亡基因表达下调与低表达的抗凋亡基因表达上调的协同作用，重塑基因平衡，从而逆转了衰老和肾阳虚证T细胞过度凋亡的趋势，恢复内环境稳态。补肾能延缓免疫衰老从单个基因到基因群的调控研究为下一步的“肾虚证基因表达谱的研究”奠定了基础。
中医药的优势在于整体协调，通过多层次、多环节、多途径的调节使得网络调控总效应对中药的应答沿着一个方向进行，同时就可以在“证”的动物模型建立的基因表达谱上观察到以药测证后的基因网络调控路线图谱。为此，2002年沈自尹首先开始“证”的基因表达谱研究。
由于肾虚和衰老无论从中医理论或是实验研究都具有相同的内涵，故取26月龄的老年大鼠为肾虚模型，和4月龄的年轻大鼠以及老年大鼠补肾药治疗组(亦就是以药测证组)进行比较。实验方法是将各组大鼠与肾虚证相关的组织(如下丘脑、垂体、肾上腺、淋巴细胞、骨骼、肝、肾等)取出来，分别提取RNA和点有成千上万个基因的芯片进行核苷酸互补的分子杂交所形成的基因表达谱作比较。从各组每个组织基因表达谱之间的比较，以及各组间全部组织的比较可以列出哪些基因由于药物作用激活而成倍地上调或下调。这样大系列有基因芯片技术形成的基因表达谱研究重复了两遍，最后综合归纳起来，可以看到老年大鼠和青年大鼠的差异比较中，其神经－内分泌－免疫和神经－内分泌－骨代谢这两大基因网络路线是明显处于衰退状态；而老年大鼠补肾治疗组和老年大鼠对照组的差异比较中，这两大基因网络路线则是处于高度激活状态。这说明补肾药能纠正肾虚证模型存在的两大基因网络紊乱。从另一角度，也可认为肾在生理状态时主要执掌这两大基因网络调控的路线及规律。这样，以药测证对肾虚证的研究就进入到生命科学的范畴。
由此沈自尹提出了“证”的新概念：“证是一种有机综合的功能态，由一个调控中心及其所属众多分子网络所构成，作为对外界反应与自我调节的基础。”
从2002年开始，沈自尹又率先在国内倡导用系统生物学的观点研究中医基础理论，中医的“证”不仅具有整体观特征，并且具有动态性、涌现性等系统生物学特征，因而再次将“证”的研究推向科学前沿。